Название: Клиническая оценка результатов лабораторных исследований - Учебное пособие

Жанр: Медицина

Рейтинг:

Просмотров: 1475

Страница: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 |



ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, т.е. одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например вирус гепатита С. ПЦР — это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методами иммуноферментного анализа или электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал — сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких, как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д. ПЦР используют также для диагностики злокачественных заболеваний, например ретинобластомы, В-клеточной лимфомы. Этот метод рекомендуется и для диагностики наследственных заболеваний, дородового определения пола плода, ДНК-дактилоскопии в криминалистике, проведения санитарно-гигиенических исследований объектов питания и водоснабжения.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:

возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организ ма, в том числе и материале, получаемом при биопсии;

возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболева ния;

возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);

высокая чувствительность метода (достаточно для диагностики наличия 1—5 копий возбудителя в пробе).

388

Обнаружение вируса гепатита С

Вирус гепатита С в материале в норме отсутствует.

В отличие от серологических методов диагностики ВГС, где обнаруживают антитела к ВГС, ПЦР позволяет установить наличие непосредственно РНК ВГС и количественно выразить его концентрацию в исследуемом материале. Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность — 10 молекул РНК ВГС в исследуемом материале достаточно для его выявления. Обнаружение антител к вирусу гепатита С подтверждает лишь факт инфицирования пациента, но не позволяет судить об активности инфекционного процесса (о репликации вируса), о прогнозе заболевания. Кроме того, антитела к вирусу гепатита С обнаруживают как в крови больных острым и хроническим гепатитом, так и у тех пациентов, кто болел и выздоровел, а нередко антитела в крови находят только спустя несколько месяцев после появления клинической картины заболевания, что затрудняет диагностику. Обнаружение вируса гепатита С в крови с использованием ПЦР — более информативный метод диагностики. Выявление ПЦР РНК вируса гепатита С свидетельствует о виремии, позволяет судить о репликации вируса в организме и является одним из критериев эффективности противовирусной терапии. Обнаружение РНК вируса гепатита С с помощью ПЦР на ранних этапах развития вирусной инфекции на фоне полного отсутствия каких-либо серологических маркеров может служить самым ранним свидетельством инфицирования. Однако изолированное выявление РНК вируса гепатита С на фоне полного отсутствия каких-либо других серологических маркеров не может полностью исключить ложноположительный результат ПЦР. В таких случаях требуются всесторонняя оценка клинических, биохимических и морфологических исследований и повторное неоднократное подтверждение наличия инфекции ПЦР.

Важное значение имеет метод ПЦР у больных хроническим вирусным гепатитом С, так как у большинства из них отсутствует корреляция между наличием вирусной репликации и активностью печеночных ферментов. В таких случаях только ПЦР позволяет судить о наличии вирусной репликации, особенно если конечный результат выражается количественно. В большинстве случаев исчезновение из сыворотки крови РНК вируса гепатита С наблюдается позже нормализации содержания печеночных ферментов, поэтому их нормализация — не основание для прекращения противовирусного лечения.

Практически важно для выявления РНК вируса исследовать методом ПЦР не только сыворотку крови, но и лимфоциты, гепатобиоптаты. Вирусы удается обнаружить в 2—3 раза чаще в ткани печени, чем в сыворотке крови [Серов Н.А и др., 1998]. При оценке результатов исследования сыворотки крови на РНК вируса гепатита С следует помнить, что виремия может быть флюктуирующей (как и изменения активности ферментов). Поэтому после положительных результатов исследования ПЦР можно получить отрицательный результат и наоборот. В таких случаях для разрешения возникающих сомнений лучше исследовать гепатобиоптаты.

Обнаружение РНК вируса гепатита С в материале с помощью ПЦР необходимо для:

разрешения сомнительных результатов серологических исследований;

дифференциации гепатита С от других форм гепатита;

выявления острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной инфекцией или контактом; определения стадии инфицированности новорожденных от серопозитив- ных по вирусу гепатита С матерей;

контроля эффективности противовирусного лечения.

Все вышеизложенные особенности оценки результатов и подходов к диагностике вируса гепатита С с помощью ПЦР относятся и к другим инфекциям.

Обнаружение вируса гепатита В

Вирус гепатита В в материале в норме отсутствует.

ПЦР позволяет определять в исследуемом материале (кровь, пунктат печени) ДНК вируса гепатита В как качественно, так и количественно. Качественное определение вируса гепатита В в материале подтверждает наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает патогенез заболевания. Количественный метод определения содержания ДНК вируса гепатита В в исследуемом материале дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, об эффективности лечения и о развитии резистентности

389

к антивирусным препаратам. Для диагностики вирусного гепатита методом ПЦР в сыворотке крови в настоящее время применяют тест-системы, чувствительность которых составляет 50—100 копий в пробе, что позволяет детектировать вирус при его концентрации 5-Ю3—104 мл [Барановский П.М. и др., 1998]. ПЦР при вирусном гепатите В безусловно необходима для суждения о вирусной репликации. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50 % больных при отсутствии HBeAg. Материалом для выявления ДНК вируса гепатита В могут служить сыворотка крови, лимфоциты, гепатобиоптаты. Оценка результатов исследования на ДНК вирусного гепатита В во многом аналогична описанному для гепатита С.

Обнаружение ДНК вируса гепатита В в материале с помощью ПЦР необходимо для:

разрешения сомнительных результатов серологических исследований;

выявления острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной инфекцией или контактом;

контроля эффективности противовирусного лечения.

Обнаружение вируса иммунодефицита человека

Вирус иммунодефицита человека в материале в норме отсутствует.

Метод ПЦР для обнаружения РНК ВИЧ может быть качественным и количественным. Качественное обнаружение РНК вируса иммунодефицита человека с помощью ПЦР используют для:

неонатального скрининга;

подтверждения результатов скринингового серологического исследования;

скрининга пациентов с высоким риском;

разрешения сомнительных результатов по иммуноблотинговому исследованию;

контроля эффективности противовирусного лечения;

определения стадии заболевания СПИД (переход инфицированности в заболевание).

Прямое количественное определение РНК ВИЧ с помощью ПЦР позволяет более точно, чем определение содержания СО4+-клеток, предсказать скорость развития СПИД у лиц, инфицированных ВИЧ, следовательно, более точно оценить их выживаемость. Высокое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с выраженным нарушением иммунного статуса и низким содержанием СО4+-клеток. Низкое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с более благополучным иммунным статусом и более высоким содержанием СО4+-клеток. Содержание вирусной РНК в крови позволяет предсказать переход заболевания в клиническую стадию. При содержании РНК-1 ВИЧ >74 100 копий/мл почти у всех пациентов развивается клиническая картина СПИД [Senior D., Holden E., 1996]. Вероятность развития СПИД в 10,8 раза больше у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови >10 000 копий/мл, чем улиц с содержанием ВИЧ-1 в крови <10 000 копий/мл. При инфекции ВИЧ прогноз непосредственно определяется уровнем виремии. Снижение уровня виремии при лечении улучшает прогноз заболевания.

Обнаружение цитомегаловируса

Цитомегаловирус в исследуемом материале в норме отсутствует.

Обнаружение частиц вируса в крови больного с помощью ПЦР используют для диагностики цитомегаловирусной инфекции и контроля эффективности противовирусного лечения. В отличие от серологических методов диагностики цитомегаловирусной инфекции, где выявляют антитела к ЦМВ, ПЦР позволяет установить наличие непосредственно ЦМВ и количественно выразить его концентрацию в сыворотке крови. Выявление ЦМВ имеет большое значение в диагностике перинатальной патологии. Внутриутробная и перинатальная передача ЦМВ может иметь тяжелые последствия. Цитомегаловирусная инфекция во время беременности часто протекает в субклинической форме и сопровождается невыраженными симптомами. ПЦР в таких случаях позволяет выявить этиологический фактор заболевания. Материалом для исследования могут служить клетки осадка мочи (новорожденных детей), эпителий цервикального канала больных женщин, околоплодные воды, соскобы с конъюнктивы глаз и урогенитального тракта, слюна, пунктаты печени.

390

Обнаружение вируса папилломы человека

Вирусы папилломы человека (human papillomavirus — HPV) являются малыми ДНК-со-держащими онкогенными вирусами, которые инфицируют эпителиальные клетки и индуцируют пролиферативные поражения. В настоящее время выделено более 70 типов вируса папилломы человека. Эпидемиологический анализ данных исследований на наличие вируса папилломы человека позволил выдвинуть концепцию об участии вирусов этой группы в развитии эпителиальных злокачественных новообразований.

Более 90 % всех цервикальных карцином позитивны на присутствие вирусов папилломы человека. Наиболее часто в материале из опухолей шейки матки обнаруживают типы 16 и 18 вирусов [Gabbot M. et al., 1997].

Вирусы папилломы человека типа 6 и 11 признаны этиологическим началом рецидивирующего респираторного папилломатоза, который обычно поражает носоглотку, трахею, гортань, может прогрессировать и стать распространенным бронхопульмональным заболеванием. В большинстве случаев папилломатоз является доброкачественным, однако может трансформироваться в плоскоклеточную карциному [Rady P.L. et al., 1997].

ДНК HPV типа 16 часто выявляют в клетках уротелиальной карциномы при раке мочевого пузыря у пациентов с иммунодефицитом [Beltran L.A., Escudero A.L., 1997].

Единственным методом обнаружения вирусов папилломы человека при перечисленных заболеваниях является метод ПЦР. Материалом для исследования служат пунктаты опухолей, лимфатических узлов, отделяемое из влагалища, носа, трахеи, моча. Обнаружение в исследуемом материале вируса папилломы человека определенного типа еще не говорит о наличии у пациента злокачественной опухоли, но требует проведения гистологического исследования субстрата болезни и последующего динамического наблюдения за ним.

Высказывается мнение о важной роли обнаружения вирусов папилломы человека в биоптатах лимфатических узлов при цервикальной карциноме, для определения объема оперативного лечения и выявления интактных и пораженных метастазами лимфатических узлов. При нахождении вирусов папилломы человека в лимфатических узлах, даже при отсутствии гистологических признаков их опухолевого поражения, результаты исследования необходимо расценивать как наличие метастазов в лимфатические узлы [Sopy Т. et al., 1997].

Обнаружение микобактерий туберкулеза

Микобактерий туберкулеза в материале в норме отсутствуют.

В отличие от серологических методов диагностики туберкулезной инфекции, где находят антитела к микобактериям туберкулеза, ПЦР позволяет выявить наличие непосредственно ДНК микобактерий туберкулеза и количественно выразить его концентрацию в исследуемом материале. Исследуемым материалом могут быть мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, моча, пунктаты из различных органов и кист и др. Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность (более 95 %). Микробиологическая диагностика туберкулеза в настоящее время — основной метод выявления больных и мониторинга эффективности лечения. Однако микробиологические анализы на туберкулез чрезвычайно продолжительны и имеют низкую чувствительность (выявление положительных проб не превышает 50 %). Диагностика туберкулеза ПЦР имеет большое диагностическое значение (время исследования 4—5 ч). В исследованиях В.И. Голышевской и соавт. (1998) показано, что результаты ПЦР в 100 % случаев совпадали с положительными результатами микроскопии и бактериологического посева и свидетельствовали о наличии ДНК микобактерий в 65 % случаев у больных туберкулезом с отрицательным результатом микроскопии и посева. Обнаружение ДНК микобактерий туберкулеза в материале с помощью ПЦР необходимо для:

быстрого обнаружения источника инфекции;

диагностики легочного туберкулеза;

диагностики туберкулеза внелегочной локализации; —контроля эффективности противотуберкулезного лечения;

раннего выявления случаев рецидивов.

Вместе с тем следует отметить, что ПЦР для диагностики туберкулеза не заменяет бактериологических методов.

391

Обнаружение Helicobacter pylori

Helicobacter pylori в исследуемом материале в норме отсутствует.

Helicobacter pylori отводится ведущая роль в этиологии хронического гастрита, язвенной болезни, рака желудка. Колонизация эпителия слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки Helicobacter pylori является одним из основных факторов возникновения хронического воспаления, называемого гастритом типа В. На фоне гастрита типа В образуются пептические язвы желудка и двенадцатиперстной кишки. Исследования последних лет показали, что развитие гастрита и язвы желудка связано в первую очередь с колонизацией слизистой оболочки токсигенными штаммами Helicobacter pylori, в то время как колонизация нетоксигенными штаммами только в небольшом проценте случаев приводит к развитию этих заболеваний. Токсигенность штаммов обусловлена продукцией вакуолярного цитоток-сина, синтез которого связан с продукцией белка с мол. массой 120 000—128 000, кодируемого геном Coag A (cytoxin-associated gene А). Присутствие токсигенных штаммов является важным фактором перерождения язвы в аденокарциному. В настоящее время основной метод, позволяющий выявлять токсигенные штаммы, — бактериологический метод. Однако в последние годы разработаны три вида тест-систем, диагностирующих Helicobacter pylori:

1-й — на основе праймеров к последовательности 16S-pPHK, позволяющих идентифицировать Helicobacter pylori как вид;

2-й — на основе праймеров к последовательности Coag А-гена;

3-й — на основе праймеров к последовательности Vac-гена, кодирующего синтез вакуолярного токсина. Только две последние тест-системы выявляют токсигенные штаммы Helicobacter pylori.

Материалом для исследования служат биоптаты слизистой оболочки желудка или кал.

В настоящее время лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori представляет собой трудную задачу, так как существует значительное число штаммов возбудителя, резистентных к антибиотикам. Helicobacter pylori имеет природную резистентность к следующим антибиотикам: ванкомицину, триметоприму, цефсулоидину и полимиксину [Ме-graud F., 1995]. Помимо природной, существует приобретенная резистентность — первичная и вторичная. Первичная резистентность возникает при приеме антибактериальных препаратов, не связанных с инфицированием Helicobacter pylori; вторичная — непосредственно в процессе лечения инфекции. В настоящее время описана резистентность Helicobacter pylori к четырем группам антибиотиков: нитроимидазолам, макролидам, фторхинолонам и производным рифампицина. Показатель первичной резистентности Helicobacter pylori к нитро-имидазолу в России составляет около 30 %, а вторичной резистентности в группах больных язвенной болезнью превышает 50 % [Иванников И.О., 1998]. Для практикующего врача важно не только диагностировать инфекцию, вызываемую Helicobacter pylori, но и еще до начала лечения знать чувствительность возбудителя к тем или иным группам антибиотиков.

В настоящее время ПЦР нашла практическое применение и в изучении феномена анти-биотикоустойчивости штаммов Helicobacter pylori. С помощью произвольно-праймерной ПЦР с использованием рестрикционных эндонуклеаз можно обнаружить точечные мутации в 23S-pPHK гене, которые обусловливают устойчивость Helicobacter pylori к макролидам. Разрабатываются тест-системы с ПЦР и для выявления точечных мутаций в генах, ответственных за устойчивость штаммов Helicobacter pylori к другим группам антибиотиков.

Обнаружение гонококков

Гонококки в материале из уретры в норме отсутствуют.

В отличие от серологических методов диагностики гонококковой инфекции, где выявляют антитела к гонококкам, ПЦР позволяет установить наличие непосредственно ДНК гонококков и количественно выразить его концентрацию в исследуемом материале. Исследуемым материалом могут быть мокрота, бронхо-альвеолярный лаваж, моча, пунктаты из различных органов и кист и др. Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность (более 95 %). ПЦР-диагностика гонореи дает положительные результаты даже при хронических формах заболеваний, когда бактериоскопические и бактериологические исследования дают отрицательные ответы.

Обнаружение гонококков в материале с помощью ПЦР необходимо для диагностики гонококковой инфекции и контроля эффективности лечения.

392

 

.

Обнаружение микоплазм

Микоплазмы в исследуемом материале в норме отсутствуют.

Микоплазмы относятся к условно-патогенным микроорганизмам, которые персистиру-ют и паразитируют на мембранах эпителиальных клеток и могут локализоваться как экстра-, так и интрацеллюлярно. Известно около 11 видов микоплазм, для которых человек является естественным хозяином. Из них клиническое значение имеют M.hominis, M.pneumoniae, M.genitalium, M.fermentas, U.urealyticum. Колонизируя слизистые поверхности, они сопровождаются хроническими воспалительными процессами урогенитального и респираторного трактов, являются этиологическим фактором ревматоидного артрита и вызывают септический артрит. В последние годы появились сообщения о роли микоплазм в развитии таких заболеваний, как острый гломеруло- и пиелонефрит. При негонококковом уретрите микоплазмы выделяются методом ПЦР у 37—43 % обследованных, при гломерулонефрите — у 47 %, при пиелонефрите — у 18 %, склерозе предстательной железы — у 41 %, при сальпингитах и цервицитах — у 50 %, при послеродовом сепсисе — у 50 % больных [Гущин А.Е. и др., 1998].

Метод ПЦР выявляет непосредственно ДНК микоплазм в исследуемом материале. Для обнаружения микоплазм при заболеваниях легочной системы лучшим материалом для ПЦР является бронхиальный лаваж. При заболеваниях мочевыводящего тракта исследуют мочу, отделяемое из уретры, влагалища, цервикального канала, сок предстательной железы. Наиболее часто при урогенитальных инфекциях обнаруживают U.urealyticum — в 20—50 % случаев, M.hominis — в 10—25 % случаев.

 

Обнаружение Chlamidia trachomatis

Chlamidia trachomatis в материале из уретры в норме отсутствуют.

Диагностика хламидиоза с помощью ПЦР — наиболее чувствительный и специфичный метод из всех, которые используются в лабораториях в настоящее время. Чувствительность метода составляет 95—97 %, а специфичность — 95—98 %. Обнаружение Chlamidia trachomatis в материале из уретры с помощью ПЦР используется для:

скрининга в популяции с высоким риском;

обнаружения Chlamidia trachomatis в моче;

разрешения сомнительных случаев при использовании других методов диагностики;

контроля эффективности проводимого лечения.

При урогенитальных инфекциях Chlamidia trachomatis в материале из уретры методом ПЦР обнаруживают в 15—40 % случаев. При ревматоидном артрите урогенитальную инфекцию выявляют у 84 % больных [Суханова Г.И., 1998]. Из них хламидиоз установлен у 28 % больных, M.hominis — у 13 %, U.urealyticum — у 10 %. Хламидии можно обнаружить у больных с ревматоидным артритом не только в отделяемом из урогенитального тракта, но и в жидкости из суставов.



Страница: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 |

Оцените книгу: 1 2 3 4 5

Добавление комментария: